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    mRNA疫苗體外合成完整解決方案
          隨著生命科學的不斷進步,mRNA作為藥物被應用到疾病治療、疫苗等領域。從1990年體外合成的mRNA第一次在細胞內表達,到2020年的mRNA疫苗在對抗新冠疫苗發揮重要作用。以mRNA為基礎的治療方式已經在醫藥領域引起了一場革命。
    mRNA(Messenger RNA、信使RNA)是將DNA中的基因信息傳遞到蛋白的中間信使。mRNA疫苗治療(見下圖)是指在體外合成mRNA,將其導入體內,mRNA進入細胞后翻譯表達出抗原蛋白,抗原刺激體內免疫系統,激活體液免疫和細胞免疫,當機體再次接觸同種抗原(細胞/病毒),可產生快速免疫應答反應,自我保護。


           mRNA疫苗具有研發速度快、靈活、生產工藝簡單、平臺化、容易擴充產能,可以用于精準化和個性化治療,一次可呈遞多種抗原等優點。mRNA疫苗屬于第三代疫苗技術(見下圖),相比于傳統疫苗需要通過將病原微生物及其代謝產物通過人工滅毒﹑減活﹑基因工程的方法制成的繁雜工序,第三代疫苗特異性更強,有效性更高,并且研發周期較快。它的結構簡單、可人工批量合成,并且可以在研發階段進行高通量篩選,大大節省研發時間。而且相較于DNA疫苗,mRNA疫苗沒有導入外源基因的遺傳風險,起效更快,效果更強。

    mRNA疫苗相對于其他疫苗的優勢  圖片引用于網絡

           mRNA疫苗具有工藝通用性好,研發速度快,能夠活化細胞免疫,刺激效果好,遞送效果好等特性。高的mRNA產量需要高效的mRNA體外合成方法,大規模生產選擇T7 RNA聚合酶體外轉錄。增強mRNA的穩定性,降低免疫原性并提升翻譯效率,最有效的解決方案是:使用加帽酶對mRNA進行加帽,使其在細胞內外穩定,降低免疫原性,并且使mRNA可以被核糖體識別,啟動翻譯程序。

          近岸蛋白質提供一系列mRNA體外合成酶及試劑,解決mRNA疫苗的關鍵痛點。所有產品均采用藥用規格原輔料生產,嚴格控制宿主蛋白質殘留、核酸殘留及常見病原體污染,符合GMP規范的產品生產與質量管理規程,保障生產過程及所有原輔料可追溯。


    產品特點:
    GMP級mRNA體外合成及修飾原料,animal-free,ampicillin-free
    產品生產、質量控制及配套文件體系,符合mRNA疫苗及藥物研發生產需求
    經過臨床使用驗證,單批次產能千萬人份,年產能50億人份
           
    mRNA疫苗體外合成關鍵步驟及相關產品:

    1、生成模板-質粒線性化 相關產品:Bsa I,GMP Grade(貨號:GMP-RE026)
            此步將構建好的質粒酶切,處理成線性化雙鏈DNA模板,用于下一步mRNA合成。
            限制性內切酶Bsa I 特異性識別雙鏈DNA中位點并進行酶切,可將模板質粒酶切線性化,作為mRNA體外合成模板;
            酶切位點:

    產品特點:
            強特異性
            受CpG、Dcm甲基化影響,剪切阻斷
            受EcoBI甲基化影響,剪切可能受影響
            不受Dam甲基化影響

    2、mRNA體外合成  相關產品:T7 RNA Polymerase, GMP Grade (貨號:GMP-E121)
           此步以DNA為模板,在體外由RNA聚合酶催化合成mRNA。
    T7 RNA Polymerase(T7 RNA聚合酶)是高度特異識別T7啟動子序列的5'→3' RNA聚合酶,以含有T7啟動子序列的單鏈或雙鏈DNA為模板,以NTP為底物,合成與啟動子下游的單鏈DNA互補的RNA。T7 RNA聚合酶是體外轉錄mRNA的關鍵酶。


    產品特點:
    高度特異識別T7啟動子
    20ul反應體系,產量可達150ug
    可對低至1ng模板進行有效轉錄
    合成長度可達15k


    體外轉錄產生的mRNA,Qsep1結果顯示,純度高,均一性好。

    3、mRNA轉錄后修飾:加帽加尾
    此步對mRNA進行修飾,合成功能完整的mRNA。



    完整mRNA結構
    3.1、mRNA加帽(Cap0)   相關產品:Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade (貨號:GMP-M062)        
          此步與3.2同時進行,在mRNA的5'端加上Cap0帽結構。
    在真核生物中,轉錄后的mRNA必需經過一系列修飾才能形成完整的結構,即在5'端形成一個帽子結構(Cap1),3’端形成PolyA尾結構。這些結構與mRNA的穩定、轉運和翻譯密切相關。
          Vaccinia Capping Enzyme(牛痘病毒加帽酶)用于給體外轉錄合成的mRNA催化加上帽子結構(Cap0),顯著改善mRNA的穩定性和翻譯能力,使mRNA可在細胞內表達蛋白,避免核酸外切酶等的降解破壞。
          mRNA的帽結構是由一個7-甲基鳥苷通過一個5′–5′三磷酸酯橋連接到mRNA 鏈的5′核苷上組成。Cap-0結構由相鄰的RNA鏈通過三種酶的依次反應形成。進一步形成cap-1結構需要2-O甲基轉移酶(Cat. No: GMP-M072, Novoprotein)參與,該修飾可以降低RNA在體內引起的細胞先天免疫反應。

    產品特點:
    高效完成mRNA加帽Cap0   
    提高mRNA的穩定性,防止被RNA酶降解                                                           
    提高mRNA的翻譯效率,提高蛋白產量

    3.2、mRNA加帽(Cap1)  相關產品:mRNA 2’-O-Methyltransferase, GMP Grad e (貨號:GMP-M072)
           此步與3.1同時進行,在mRNA的5'端加上Cap0帽結構的基礎上,再將Cap0轉化為Cap1結構。
           真核生物中,mRNA的轉錄后須經系列修飾,在5'端形成一個特殊結構,即帽子結構,3’端形成PolyA尾結構。這些結構與mRNA的穩定、轉運和翻譯密切相關。已知Cap1結構存在于所有真核生物mRNA,在穩定mRNA結構和提高翻譯效率方面起重要作用。研究表明,體外轉錄修飾得到的Cap1結構mRNA更不容易被免疫系統的RNA感受器(RIG-I)識別,因此免疫刺激更低。
           mRNA Cap 2′-O-Methyltransferas (2′-O-甲基轉移酶)可利用 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體, 在 RNA 5′末端緊鄰帽結構(Cap 0)的第一個核苷酸的 2′-O 上添加甲基基團,形成帶有 Cap 1 結構的 mRNA。Cap1 結構能增強 mRNA 的翻譯效率,從而可提高轉染后 mRNA 編碼的蛋白表達水平。該酶只能以帶 7-甲基鳥苷帽結構(m7GpppN)的 RNA 為底物,不會作用于 5′末端為pN、ppN、 pppN 或 GpppN 的 RNA。帶 7-甲基鳥苷帽結構(m7GpppN)的 RNA 可通過 Vaccinia Capping System(Cat. No: GMP-M062, Novoprotein)來制備。

    產品特點:
    使mRNA的Cap 0帽子甲基化為 Cap 1帽子
    提高 RNA 的翻譯效率,提高蛋白產量
    進一步降低免疫原性


    完整mRNA在細胞內表達GFP蛋白,加帽酶與帽類似物對比

    3.3、mRNA加尾(PolyA)  相關產品:E. coli Poly(A) Polymerase, GMP Grade (貨號:GMP-M012)
          此步在mRNA的3'端加上PolyA尾。
          真核生物中,mRNA的轉錄后須經系列修飾,在5'端形成一個特殊結構,即帽子結構,3’端形成PolyA尾結構。這些結構與mRNA的穩定、轉運和翻譯密切相關。Poly A與成熟mRNA的穩定性、翻譯起始以及出核運輸有關,體內轉錄后修飾中,polyA聚合酶在RNA 3’-OH上逐一引入100-200個A堿基。
    體外轉錄RNA過程中,E. coli Poly (A) Polymerase(加尾酶) 不依賴模板的存在,可以催化 ATP 以 AMP 的形式依次摻入到 RNA 的 3′末端,即在 RNA 的 3′末端加多聚 A 尾。Poly (A) 聚合酶具有很高的加尾效率,可以在 RNA 的 3′末端加入 20~200 個 A 堿基。最大程度還原體內加尾過程。
    產品特點:
    穩定mRNA的存在形式
    引導轉錄終止
    提高RNA在真核細胞中的翻譯效率

    4、其他相關產品
    4.1、防止mRNA降解  相關產品:RNase inhibitor, GMP Grade (貨號:GMP-E125)
    在流程2-3 mRNA合成與修飾中加入RNase Inhibitor,防止RNA降解。
    RNase Inhibitor可與RNase  A形成1:1復合體,對RNase 有極強非競爭性抑制,保護mRNA轉錄后不被降解
    產品特點:
    強抑制RNase活性
    穩定性強

    4.2、降解模板DNA  相關產品:DNase I, GMP Grade (貨號:GMP-E127)
            在流程2 RNA合成結束后,去除模板DNA。
    DNase I將單鏈或雙鏈DNA隨機分解。


    DNase I 去除RNA樣本種的DNA殘留

    4.3、增加mRNA產量  相關產品:Pyrophosphatase, Inorganic (yeast), GMP Grade (貨號:GMP-M036)
            在流程2 RNA合成過程中加入無機焦磷酸酶,增加RNA產量。
            無機焦磷酸酶PPase(Pyrophosphatase, Inorganic)可催化無機焦磷酸鹽水解生成正磷酸鹽(P2O7-4+H2O+PPase→2HPO4-2),一方面可去除無機焦磷酸鹽對反應體系的抑制,另一方面為反應提供熱力學動力,促進產物的生成。常用于RNA、DNA、蛋白質的生物合成中,是一種良好的輔劑,在mRNA疫苗體外大規模合成中加入可顯著提高產量。

     
    無機焦磷酸酶去除mRNA合成過程中產生的焦磷酸,提高mRNA產量

    轉載來源:RNAScript
    原文:近岸蛋白質網站 Fr. https://www.novoprotein.com.cn/Cn/product/inproducts/id/536/catid/38.html


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