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    Cap 1 Capping System

    貨號 M082 售價 詢價
    規格 10T/100T CAS號
    • 產品簡介
    • 相關產品

    產品信息

    貨號

    名稱

    規格

    GMP-M062-01A

    Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade

    500U

    GMP-M072-01A

    mRNA Cap 2-O-Methyltransferase, GMP Grade

    2500U

    GMP -S062

    SAM (32mM), GMP Grade

    0.5ml

    GMP-M062-01A

    Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade

    500U

    M062-YH01-01A

    Vaccinia Capping System

    500U

    M072

    mRNA Cap 2-O-Methyltransferase

    2500U/2500U×5

    M082

    Cap 1 Capping System

    10T/100T

    產品簡介

          牛痘病毒加帽體系利用牛痘病毒加帽酶及相關組分,將7-甲基鳥苷帽結構(m7Gppp,Cap0)加到 RNA 的 5′ 末端。在真核生物中,該結構與mRNA的穩定、轉運和翻譯密切相關。使用酶促反應為RNA加帽是一種簡單有效的方法,且帽結構與天然Cap 0結構完全一致,能顯著改善用于體外轉錄、轉染和顯微注射的RNA的穩定性和翻譯能力。這種酶由兩個亞基(D1和D12)組成,D1亞基執行RNA三磷酸酶和鳥苷轉移酶的功能,D12亞基執行鳥嘌呤甲基轉移酶的功能,它們對于添加一個完整的Cap 0結構m7Gppp5′N都是必須的(圖1)。
          由牛痘病毒加帽酶構建的帶帽RNA產品具有“cap 0”結構。通過在加帽反應中同時使用mRNA Cap 2'-O-甲基轉移酶和牛痘病毒加帽酶,Cap 0-RNA可以轉化為“ cap 1”結構。 mRNA Cap 2'-O-甲基轉移酶通過將甲基從供體分子SAM轉移到cap 0- RNA 5’端緊鄰帽結構的第一個核苷酸的2'-O位置,從而從Cap 0-RNA制備Cap 1-RNA。


         圖1. 參與mRNA 加帽的酶促途徑。Cap 0 結構 RNA 的產生需要牛痘病毒加帽酶:該酶兼具三磷酸酶、鳥苷轉移酶和鳥嘌呤甲基轉移酶的功能。其中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是甲基供體。一旦產生了Cap 0 結構,就可以通過2'-O-核糖甲基轉移酶進一步修飾以產生Cap 1 結構。本圖引自Michael Beverly , Amy Dell, Parul Parmar, Leslie Houghton et al (2016). Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS. Anal Bioanal Chem. 

         本體系可用于 IVT RNA 的加帽反應,使加帽反應在 1h 之內完成,效率接近 100%,并且保證正確的方向。IVT 推薦使用近岸蛋白質 T7 High Yield RNA Transcription kit(貨號:E131)。 
    產品用途:
    體內或體外翻譯前 mRNA 的加帽和 mRNA 的 5’末端標記。 
    提高 RNA 的翻譯效率; 
    改善 mRNA 在顯微注射和轉染后的表達。 
    應用實例:

    完整mRNA在細胞內表達GFP蛋白,加帽酶與帽類似物對比
    注意事項:   
    SAM:SAM 在pH 7-8,37°C條件下不穩定,需要在反應開始之前新鮮配置。為避免 SAM 降解,該工作液需要保存于冰上。 
    RNA:在加帽體系使用之前,應將體外轉錄反應產生的 RNA 進行純化并溶解于 RNase-free 水中,不能將 RNA 溶解在 EDTA溶液或其他鹽溶液中。 
    RNA 二級結構:一些 RNA 轉錄本可能形成穩定的二級結構(同源二聚體和發卡結構),如二級結構發生在轉錄本的 5'端會影響加帽效率。在與加帽酶反應之前加熱 RNA 可以去除轉錄產物 5′端的二級結構,如果轉錄產物的 5′端結構復雜,可以把加熱時間延長至 10min,加帽反應時間可延長至 60min。 
    Cap 0-和 Cap 1-mRNA:Cap 0-和 Cap 1-mRNA 之間的差異在 RNA 5'端緊鄰帽結構的第一位核苷酸(N1)是否具有 2'-O-甲基。在高等真核細胞中,該甲基化是天然加帽過程的一部分,Cap 1 結構提高了 mRNA 的翻譯效率。


    Poly(A) 尾:如果加帽的 RNA 需要添加 3'-poly(A)尾巴,可以使用近岸蛋白質 E. coli Poly(A) Polymerase(貨號:M012)進行加尾。加帽和加尾后的 RNA 需在進行 RNA 轉染實驗前做純化處理。 
    RNase Inhibitor:在配置反應體系時,可以加入 0.5 μl 近岸蛋白質 RNase 抑制劑(貨號:E125),同時去掉等體積的 RNase-free水。 
    For research and manufacturing use only.



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